Kaedah penyelidikan genetik molekul

Untuk meneroka dan mengenal pasti variasi dalam struktur DNA menggunakan kaedah genetik molekul. Bagi setiap kawasan DNA, yang meneroka rantau ini daripada kromosom, gen atau allele, kaedah berbeza. Mendasari setiap kaedah genetik molekul terdiri daripada beberapa atau manipulasi lain RNA dan DNA. Semua kaedah ini dicirikan oleh kerumitan yang sangat besar, tanpa keadaan makmal tidak boleh dibawa keluar ekspres dan kakitangan mestilah yang berkelayakan. Kerja ini dijalankan dalam beberapa peringkat.

peringkat

Pertama, RNA atau DNA sampel untuk dihasilkan. Di sini, kaedah genetik molekul boleh digunakan untuk hampir mana-mana bahan: setitik darah, leukosit, fibroblas budaya, mukosa (dikikis), walaupun folikel rambut, - DNA boleh diperolehi dari mana-mana sampel. Ia adalah sesuai untuk menggunakan mana-mana kaedah genetik molekul dan pelbagai pilihan mereka dan telah DNA lama diasingkan disimpan beku. Peringkat kedua adalah khusus untuk pengumpulan serpihan dikehendaki (penguatan) DNA, kerana ia membantu memastikan tindak balas rantai polymerase in vitro (dalam vitro tanpa penglibatan organisma hidup). Hasilnya, yang dipilih mendarab serpihan DNA oleh tindak balas rantai ini, dan jumlah kenaikan DNA berjuta-juta kali.

Langkah ketiga dalam kaedah penyelidikan genetik molekul dianggap sekatan berlipat ganda DNA (pemecahan ini, mengoyak atau memotong). Sekatan dilakukan oleh elektroforesis pada polyacrylamide atau gel agarose. Kaedah molekul genetik mengkaji serpihan DNA yang membolehkan semua orang untuk mengambil kedudukan yang tertentu dalam gel. Selepas itu, gel dirawat dengan ethidium bromida, mampu mengikat kepada DNA, penyinaran dengan cahaya ultraungu, maka ia adalah mungkin untuk memerhatikan bahagian luminescence. Molekul kaedah-kaedah diagnosis genetik adalah pelbagai dan banyak, tetapi kedua-dua langkah-langkah pertama adalah biasa kepada semua. Tetapi untuk mengenal pasti serpihan DNA, gel ini boleh berwarna, dan banyak kaedah lain yang sedia ada.

spesies

Kaedah yang paling terus dan meluas untuk mengesan mycobacteria mungkin termasuk kaedah molekul DNA genetik pembelajaran di atas. Asasnya ialah, untuk mengenal pasti bahan rantaian imbasan serpihan tertentu DNA patogen. Molekul teknik diagnostik genetik tidak lagi mempunyai cara yang lebih berkesan untuk mengenali penyakit seperti batuk kering. Menggunakan tindak balas rantai polymerase (PCR), anda boleh yakin bahawa DNA asal akan meningkatkan bilangan salinan dalam satu juta kali, iaitu, akan ada penguatan, dan ia akan memaparkan keputusan. Tahap sensitiviti yang sangat tinggi - lebih daripada sembilan puluh lima peratus, yang merupakan kelebihan utama kaedah ini.

Yang lain daripada kaedah molekul genetik penyelidikan mengenai keberkesanan hasil berbilang salinan literal dua kali ganda, kerana dalam kes ini sampel penggubalan menunjukkan urutan oligonucleotide tertentu meningkat kepada seratus enam kali. Walaupun diagnosis budaya di tuberculosis sistem pernafasan jauh lebih rendah kepekaannya. Ini adalah mengapa perubatan moden adalah berdasarkan kaedah genetik molekul diagnosis batuk kering. Satu kaedah diterangkan adalah berkesan terutamanya apabila berurusan dengan patogen kepelbagaian antigen yang tinggi, menentukan cara yang lain adalah lebih sukar - memerlukan khas media nutrien dan memupuk masa yang panjang. kaedah genetik biokimia dan molekul menghasilkan kesan yang sangat berbeza pada keputusan.

diagnosis batuk kering

Marshall PCR diagnosis batuk kering yang paling biasa menggunakan mereka jujukan DNA yang khusus untuk semua empat jenis penyakit. Untuk mencapai matlamat ini sering menggunakan primers yang mengesan urutan IS unsur (IS-986, IS-6110), kerana elemen-elemen ini mencirikan spesies mudah berhijrah Mycobacterium tuberculosis dan sentiasa berbilang salinan di dalam genom. Juga pengekstrakan DNA boleh dijalankan dari budaya yang tulen dan Klinikal (kahak pesakit) dengan apa-apa kaedah lain yang sesuai. Sebagai contoh, terdapat kaedah Boom mana penampan lysis digunakan berdasarkan tiosianat guanidine dan silika sebagai DNA pengangkut. Bilangan pesakit yang berbeza bakteriologi miskin meningkat setiap tahun, dan oleh itu dalam amalan klinikal telah mewujudkan tahap yang sama sekali berbeza dalam organisasi: Kaedah molekul genetik mengkaji DNA telah memainkan peranan utama dalam diagnosis.

Walau bagaimanapun, kita harus mengakui bahawa ia tidak tanpa kelemahan. Kaedah PCR ialah penggunaan sering membawa sejumlah besar hasil positif palsu, dan sebab itu adalah bukan sahaja kesilapan teknikal, tetapi juga ciri-ciri kaedah itu sendiri. Di samping itu, dengan menggunakan kaedah ini diagnosis untuk menentukan daya maju mycobacteria, yang telah dikenal pasti, ia adalah hanya mustahil. Tetapi kelemahan ini tidak adalah yang paling penting. kaedah genetik molekul diagnostik PCR melibatkan risiko pencemaran DNA mycobacterial. keperluan pensijilan untuk sebab ini bahawa untuk makmal-makmal PCR direka khas keras, mereka memerlukan tiga premis berasingan. teknologi PCR adalah moden dan sangat kompleks, ia memerlukan penggunaan peralatan yang sesuai dan kakitangan tinggi terlatih.

bacterioscopy

Apabila keputusan diagnosis analisis mesti dibandingkan dengan data lain: pemeriksaan klinikal, radiografi, smear mikroskop, tanaman dan juga tindak balas kepada rawatan tertentu yang sangat penting. Dalam siri ini, kajian PCR hanya salah satu komponen. Mengesan patogen dalam diagnosis awal boleh menjadi yang paling mudah dan paling cepat kaedah - bakteriologi.

Ada menggunakan mikroskop cahaya (pewarna Ziehl-Neelsen) dan pendarfluor (fluorochromes pewarna). Kelebihannya ialah kelajuan smear keputusan. Tetapi kelemahan adalah betul dianggap kapasiti terhad kerana sensitiviti yang rendah. Walau bagaimanapun, kaedah ini diberikan cadangan WHO sebagai yang paling ekonomi dan tanah untuk mengesan pesakit batuk kering. Pengesanan kaedah bakteriologi mycobacteria mempunyai nilai ramalan dan anggaran perkumuhan kuantitatif bakteria. Lebih yakin untuk berurusan dengan ia molekul kaedah penyelidikan genetik batuk kering.

budaya

pengesanan yang lebih baik mycobacteria mengiktiraf kajian budaya. Menyemai bahan patologi ia dibuat ke dalam medium telur: Mordovsky, Finn II, LJ, dan sebagainya. Penanda aras rintangan mycobacteria kepada ubat-ubatan dan bukti tidak langsung keberkesanan beberapa mycobacteria dan tanah jajahan mereka dalam vitro, jika kaedah digunakan budaya penyelidikan. Untuk meningkatkan peratusan pengasingan mycobacteria inokulasi bahan patologi diadakan di pelbagai persekitaran.

Memenuhi keperluan pelbagai budaya, patogen termasuk geran dan cecair. Digunakan dalam sistem ini dan pertumbuhan Vantes automatik jenis pemeteran. Tanaman perlu diadakan di pengeraman sehingga tujuh hingga lapan minggu. Pada masa ini tanaman dengan kekurangan pertumbuhan boleh dianggap negatif. Cara yang paling berkesan untuk mengesan Mycobacterium tuberculosis mempertimbangkan sampel biologi: diagnostik bahan menjangkiti babi guinea, yang amat mudah terdedah kepada TB.

beberapa tokoh

bidang menarik pengajian, yang dirasmikan oleh diagnostik PCR adalah untuk mengkaji M. tuberculosis - jangkitan pendam. Konsep moden jangkitan TB menunjukkan bahawa daripada seratus orang yang berada dalam hubungan dengan M. tuberculosis, sembilan puluh mungkin akan dijangkiti, tetapi hanya sepuluh daripada mereka adalah penyakit yang aktif sedang dibangunkan. Lain-lain mempunyai imuniti TB, dan kerana sembilan puluh peratus daripada kes-kes jangkitan masih terpendam. Mengesan corak yang ia telah membantu kaedah genetik molekul.

Pakar genetik mengatakan bahawa lima puluh lima peratus daripada orang-orang yang tanaman patologi bahan adalah negatif, lapan puluh peratus daripada orang yang dijangkiti dengan M. batuk kering, tetapi mengalir tanpa manifestasi radiografi penyakit, PCR balas positif yang diterima. Ia adalah satu kaedah diagnostik genetik membantu mengenal pasti pesakit yang mempunyai risiko oleh kajian PCR, dengan hasil analisis mereka (mikroskop dan budaya) telah negatif, dan jangkitan subklinikal M. tuberculosis hadir.

penyelidikan moden

Persekutuan Rusia dan makmal bakteriologi menggunakan kaedah dipercepatkan kepekatan mutlak: aktiviti reductase nitrat mycobacteria diuji oleh Griess reagen. pusat anti-TB menggunakan kaedah yang membolehkan untuk menentukan rintangan dadah. pembenihan ini dalam media cecair, di mana automatik radiometrik dan sistem perakaunan pendarfluor pertumbuhan mycobacteria. Analisis ini dilakukan dengan cepat - sehingga dua minggu.

Pada masa ini, kaedah baru sedang dibangunkan: rintangan dadah mycobacteria diukur pada tahap genotip. Kajian mekanisme molekul gen rintangan dan menunjukkan kehadiran dalam mycobacteria. Gen ini dikaitkan dengan penentangan terhadap ubat-ubatan tertentu. Sebagai contoh, gen Kasa, Inha, katG tahan isoniazid, gen rpoB - rifampicin gen RNA 16Sp dan rpsL - streptomycin, emb1 - untuk Ethambutol, Gyra - a fluoroquinolone dan sebagainya.

mutasi

Diagnosis moden meningkat dengan ketara kaedah peringkat molekul genetik untuk mengkaji DNA dan dibenarkan menjalankan kajian berskala besar mutasi dalam semua spektrum mereka. Sekarang kita tahu bahawa mutasi yang paling biasa dalam 516, 526 dan 531 codons gen rpoB, dan dikenalpasti rintangan kepada pelbagai ubat. Terdapat pelbagai keseluruhan kaedah untuk menaip mycobacteria menggunakan bukan sahaja kaedah tradisional - biokimia, biologi dan budaya, tetapi juga digunakan secara meluas teknik genetik molekul moden. Sudah ada yang mencukupi dan menyediakan kaedah diagnosis yang betul untuk mengesan penyakit monogenic. Mereka adalah berdasarkan kepada kajian DNA di kawasan yang tepat gen tertentu. Ini biasanya satu proses yang kompleks, memakan masa dan mahal, tetapi data yang disediakan oleh analisis genetik molekul, adalah lebih tepat dan bermaklumat daripada data semua analisis lain.

Ia telah lama diketahui bahawa DNA tidak berubah untuk kehidupan keseluruhan organisma bahawa dalam mana-mana sel-sel odnakova ternukleus, dan ini menjadikan ia mungkin untuk mengambil analisis benar-benar semua sel-sel badan, di mana-mana peringkat ontogeny. Gen rosak boleh dikesan sebelum kemunculan gejala pertama penyakit-besaran klinikal, serta pada orang heterozigot sihat, tetapi mempunyai mutasi dalam gen. Molekul penyakit keturunan genetik kaedah diagnostik membenarkan untuk mendedahkan (pendekatan langsung, DNA-diagnostik), dan juga untuk menganalisis pengasingan penyakit dalam keluarga dengan penanda lokus DNA (polimorfisme genetik), yang berkait rapat dengan gen yang rosak (iaitu, pendekatan tidak langsung DNA-diagnostik). Secara langsung atau tidak langsung - sebarang diagnostik DNA adalah berdasarkan kepada kaedah mengenal pasti bahagian yang ketat ditakrifkan daripada DNA manusia.

kaedah langsung

kaedah langsung diagnosis DNA adalah apabila penyakit keturunan pelakunya gen yang diketahui, dan juga diketahui, dan jenis mutasi itu. Sebagai contoh, yang sesuai kaedah langsung dalam beberapa penyakit. Ini chorea Huntington (sambungan CTG-ulangan), phenylketonuria (R408W), cystic fibrosis (delF508, mutasi utama) dan sebagainya. Kelebihan utama kaedah langsung ialah ketepatan diagnostik milik penuhnya, dan tidak ada keperluan untuk melakukan analisis DNA daripada ahli keluarga yang lain. Jika mutasi dalam gen yang sepadan ditemui, ia membolehkan tepat meluluskan diagnosis keturunan, genotip penentuan untuk sepanjang keluarga terbeban.

Satu lagi kelebihan diagnosis terus dianggap mengenalpasti pembawa heterozigot mutasi buruk daripada saudara-mara dan ibu bapa yang meninggal dunia akibat penyakit ini. Hal ini terutama berlaku untuk penyakit autosomal resesif. Kelemahan kaedah terus juga boleh didapati. Untuk memohon mereka, anda perlu tahu menyetempatkan gen tidak normal, exon-intron struktur spektrum dan mutasi itu. Tidak semua penyakit monogenic hari ini telah menerima maklumat tersebut. kaedah langsung Informativeness tidak boleh dianggap lengkap, kerana satu dan gen yang sama mungkin mempunyai sebilangan besar mutasi patologi yang menyebabkan perkembangan penyakit keturunan.

kaedah tidak langsung

kaedah tidak langsung dalam bidang diagnostik DNA digunakan sama sekali, dalam kes-kes lain, jika gen yang rosak tidak dikenal pasti, tetapi hanya chromosomally, atau jika diagnosis garis tidak memberikan hasil (ia berlaku, jika gen organisasi molekul yang kompleks atau sebahagian besar, jika terdapat banyak mutasi patologi). kaedah tidak langsung dilakukan analisis pengasingan penanda polimorf dalam alel keluarga. Penanda ditemui di rantau kromosom yang sama atau locus berkait rapat dengan penyakit ini dan mewakili potongan atau sisipan, penggantian tempat, ulangan, dan polymorphism mereka adalah disebabkan oleh jumlah yang berbeza daripada sel-sel di dalam blok.

Paling mudah untuk diagnosis mikrosatelit dipertimbangkan dan minisatellite polimorfisme tidak langsung, yang diedarkan secara meluas di genom manusia. nilai mereka dinyatakan dalam kandungan maklumat yang tinggi, jika kerosakan kepada jarak genetik antara penanda dan gen tidak terlalu besar. Dalam kes kedua, ketepatan anggaran ditentukan sebahagian besarnya kekerapan penggabungan semula antara penanda polimorfik dan kerosakan. kaedah-kaedah diagnosis tidak langsung juga menyediakan langkah awal mandatori frekuensi alel kajian penduduk dianalisis di kalangan pesakit dan pembawa mutasi, ditambah keperluan untuk menentukan kebarangkalian penggabungan semula tak seimbang dan melekat penanda dan alel mutan.

kaedah lain

segmen pendek RNA atau DNA, serta gen tunggal digambarkan di bawah kajian mikroskopik tidak boleh, oleh itu, untuk mengenalpasti mutasi diperlukan oleh diagnosis genetik molekul. Terdapat "Projek Genom Manusia", serta kemajuan lain dalam genetik molekul meluaskan kemungkinan diagnosis penyakit keturunan - kedua-duanya sebelum dan selepas bersalin. Kaedah-kaedah ini boleh memberikan pengesanan awal dan membuat lebih dr satu ramalan dan penyakit monogenic, yang pertama berlaku dalam dewasa. Malangnya, disebabkan keupayaan teknikal kajian genetik molekul kadang-kadang di luar had etika yang ditetapkan berhubung dengan warisan, terutama apabila diagnosis berada di zaman remaja dan kanak-kanak.

Struktur dan berangka keabnormalan kromosom adalah sebab-sebab yang paling biasa penyakit dan kanser, dan banyak kecacatan. penyelewengan kromosom perlu dikenal pasti, yang penting untuk kaunseling keluarga - untuk menilai ramalan, bersama-sama dengan risiko pembiakan dalam kehamilan masa depan. analisis kromosom adalah "standard emas" diagnosis genetik, tetapi ia adalah terhad. Hanya kaedah analisis genetik molekul boleh melakukan lebih banyak, kerana tidak digunakan pengklonan label pendarfluor teknologi berasaskan mampu kepekaan yang tinggi mereka untuk mengenal pasti perubahan kromosom halus yang mustahil untuk mengesan klasik kajian sitogenetik. Teknik-teknik ini semakin berkembang keupayaan diagnostik kami, apabila diperiksa, kanak-kanak kurang upaya pembangunan, terencat akal, dengan pelbagai penyakit keturunan lain.

penemuan

Ia adalah sangat penting untuk umat manusia adalah struktur gen dan fungsi ilmu, jenis kepelbagaian, keupayaan untuk mengesan penyakit keturunan yang berlaku berkaitan dengan perkembangan genetik molekul. kaedah-kaedah bertujuan untuk kajian molekul DNA - dan apabila ia adalah perkara biasa, dan apabila ia rosak. Penyediaan urutan asid deoksiribonukleik nukleotida (DNA) diperluaskan secara berperingkat-peringkat daripada menerima sampel untuk mengenal pasti serpihan individu. Pengasingan DNA genomik dari sel-sel, sekatan (berair), penguatan (pengklonan), elektroforesis serpihan (memisahkan caj elektrik mereka dan berat molekul oleh gel agarose). Pengenalan serpihan tertentu di permukaan jalur diskret.

Kemudian masuk ke penapis khas perbuatan, di mana pas setiap penghibridan serpihan dengan serpihan DNA diklon atau kuar radioaktif sintetik adalah kawalan, yang akan sama dengan setiap sampel ujian. Jika anda mengubah kedudukan atau panjang berbanding dengan siasatan, jika serpihan baru atau hilang - semua ini menunjukkan bahawa gen yang dianalisis telah menjalani penyusunan semula dalam urutan nukleotida. Terdapat lapan teknik asas kajian genetik molekul: penjujukan (penentuan urutan DNA), tindak balas rantai polymerase (peningkatan dalam bilangan urutan), penyediaan primers dikenali gen, pengklonan DNA, penghasilan molekul rekombinan berasal protein disebabkan oleh molekul rekombinan, mewujudkan satu set lengkap (koleksi perpustakaan) klon serpihan yang diperolehi dengan menggunakan sekatan.