Pendarfluor mikroskop: prinsip-prinsip kaedah

Penyerapan dan semula pelepasan-cecair cahaya bukan organik dan organik lagi adalah hasil daripada pendar atau pendarfluor. Perbezaan antara fenomena adalah tempoh jangka masa di antara penyerapan dan pelepasan fluks cahaya. Apabila pendarfluor proses ini berlaku hampir serentak, manakala pendar - dengan beberapa kelewatan.

maklumat sejarah

Pada tahun 1852, ahli sains British Stokes, mula diterangkan pendarfluor. Beliau memperkenalkan istilah baru sebagai hasil eksperimen dengan fluorspar, yang memancarkan cahaya merah di bawah cahaya ultraungu. Stokes berkata satu fenomena yang menarik. Didapati bahawa panjang gelombang sinaran neon sentiasa lebih besar daripada aliran cahaya pengujaan.

Untuk mengesahkan hipotesis dalam abad ke-19 terdapat banyak eksperimen. Mereka menunjukkan bahawa pelbagai sampel berkilau di bawah pengaruh cahaya ultraviolet. Antara bahan-bahan, antara lain, menjadi kristal, resin, mineral, klorofil, dadah mentah, sebatian bukan organik, vitamin, minyak. Penggunaan langsung pewarna untuk ujian biologi hanya bermula pada tahun 1930

Pendarfluor mikroskop: Huraian

Antara bahan yang digunakan dalam separuh pertama kajian abad ke-20 dipamerkan kekhususan tinggi. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Terima kasih kepada prestasi, yang tidak boleh dicapai dengan melakukan perbandingan kaedah, kaedah pendarfluor mikroskop telah menjadi satu alat yang penting dalam penyelidikan bioperubatan dan biologi. Sama-sama keputusan penting telah diperolehi, dan bahan-bahan.

? Apa kelebihan melakukan kaedah pendarfluor mikroskop? Menggunakan bahan-bahan baru telah menjadi mungkin dan pemilihan sel yang sangat khusus komponen submicroscopic. Pendarfluor mikroskop boleh mengesan molekul tunggal. Pelbagai pewarna membolehkan pengenalpastian beberapa item sekaligus. Walaupun resolusi spatial yang terhad had pembelauan peralatan, yang, seterusnya, bergantung kepada sifat-sifat tertentu sampel, pengenalan molekul di bawah tahap ini juga agak mungkin. Pelbagai sampel selepas penyinaran pameran autofluorescence. Fenomena ini digunakan secara meluas dalam petrologi, industri semikonduktor botani.

ciri-ciri

Mengkaji tisu haiwan atau patogen sering rumit atau terlalu lemah atau sangat kuat autofluorescence mutasyaabihaat. Walau bagaimanapun, nilai dalam kajian memperoleh pengenalan ke dalam komponen bahan teruja pada panjang gelombang tertentu dan pemancar keamatan aliran cahaya yang diperlukan. Fluorochromes bertindak sebagai pewarna mampu bebas melekat pada struktur (yang boleh dilihat atau tidak dapat dilihat). Oleh itu mereka mempunyai pemilihan yang tinggi ke sasaran, dan hasil kuantum.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Pendarfluor mikroskop telah digunakan secara meluas sejak kemunculan pewarna asli dan tiruan. Mereka mempunyai profil intensiti tertentu pelepasan dan pengujaan dan disasarkan kepada sasaran biologi tertentu.

Pengenalan molekul individu

Selalunya, dalam keadaan yang ideal, anda boleh mendaftar cahaya elemen yang berasingan. Untuk ini, antara lain, ia adalah perlu untuk menyediakan bunyi yang cukup rendah daripada pengesan dan latar belakang optik. molekul fluorescein kegagalan kerana photobleaching boleh mengeluarkan sehingga 300 ribu. Foton. Pada 20% kecekapan pengumpulan proses dan boleh mendaftarkannya dalam jumlah kira-kira 60 ribu.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. mikroskop pendarfluor berdasarkan fotodiod runtuhan atau pendaraban elektronik, membenarkan penyelidik untuk memerhatikan gelagat molekul individu melalui kedua, dan dalam beberapa kes walaupun minit.

kerumitan

Isu utama yang memihak kepada penindasan latar belakang bunyi optik. Kerana kenyataan bahawa banyak bahan yang digunakan dalam reka bentuk penapis dan kanta mempamerkan beberapa autofluorescence, usaha-usaha ahli-ahli sains pada peringkat awal telah berorientasikan kepada pengeluaran komponen mempunyai pendarfluor yang rendah. Walau bagaimanapun, eksperimen seterusnya telah membawa kepada kesimpulan baru. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Khususnya, ia telah mendapati bahawa pendarfluor mikroskop, berdasarkan pantulan, ia membolehkan untuk mencapai latar belakang yang rendah dan cahaya pengujaan intensiti yang tinggi.

mekanisme

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Prinsip pendarfluor mikroskop, berdasarkan pantulan ialah penggunaan gelombang cepat berlalu atau cepat berlalu. Ia berlaku di sempadan antara media dengan berbeza indeks biasan. Dalam kes ini, rasuk cahaya melalui prisma itu. Ia mempunyai parameter indeks biasan yang tinggi.

prisma yang bersebelahan dengan penyelesaian atau kaca akueus dengan parameter rendah. Jika pancaran cahaya ditujukan ia pada sudut yang lebih kritikal, rasuk sama sekali terpancar dari antara muka. Fenomena ini, seterusnya, menyebabkan gelombang nonpropagating. Dalam erti kata lain, medan elektromagnet yang dihasilkan yang menembusi ke dalam medium dengan indeks biasan parameter yang lebih rendah untuk jarak kurang daripada 200 nanometer.

Gelombang cepat berlalu keamatan cahaya adalah mencukupi untuk merangsang fluorophores. Walau bagaimanapun, kerana kedalaman yang sangat kecil, jumlah itu akan menjadi sangat kecil. Hasilnya ialah latar belakang tahap rendah.

pengubahsuaian

Pendarfluor mikroskop adalah berdasarkan pantulan, boleh dilaksanakan dengan epi-pencahayaan. Ini memerlukan kanta dengan bukaan berangka tinggi (sekurang-kurangnya 1.4, tetapi adalah wajar bahawa ia telah mencapai 1,45-1,6), dan sebahagiannya diterangi radas lapangan. Yang terakhir ini dicapai dengan saiz tempat kecil. Untuk keseragaman yang lebih besar menggunakan cincin nipis, yang disekat oleh sebahagian sungai. Untuk sudut genting, selepas itu terdapat sejumlah renungan, kita memerlukan tahap yang tinggi pembiasan medium perendaman dalam lensa dan kaca penutup mikroskop.